De novo測序即在不依賴參考基因組的情況下對某物種基因組進行從頭測序、拼接和組裝，從而獲得全基因組單堿基精度序列圖譜。全基因組序列圖譜完成后，可以構(gòu)建該物種的基因組數(shù)據(jù)庫；為該物種的后基因組學(xué)研究搭建平臺；為后續(xù)的基因挖掘、功能驗證提供DNA序列信息。
| 產(chǎn)品類型 | 測序策略 | 推薦數(shù)據(jù)量 | 周 期 |
| 動植物基因組de novo | 二/三代平臺 | 簡單基因組：survey（100X PE150），草圖（HiFi：20-35X），Hi-C輔助組裝（100X），注釋（推薦Iso-seq 50G subreads）； 復(fù)雜基因組：survey（100X PE150），草圖（HiFi≥30X），Hi-C輔助組裝（100X），注釋（推薦Iso-seq 50G subreads）。 | 基因組草圖組裝最快8自然日，組裝+注釋+進化最快50自然日（視基因組復(fù)雜程度而定）。 |
| 產(chǎn)品類型 | 送樣要求 |
| 基因組survey（二代平臺） | 樣品類型：基因組DNA樣品 樣品需求量：小片段文庫≥0.2 μg 樣品濃度：≥5 ng/μl 樣品純度：OD260/280=1.8-2.2、OD260/230=0.8-2.5 樣品質(zhì)量：基因組完整，DNA主帶清晰、無降解、無污染 |
| 基因組de novo（三代平臺） | DNA總量：HiFi≥6 μg 濃度：≥30 ng/μl 質(zhì)量：基因組完整性，DNA主帶：HiFi≥30 Kb 純度：OD260/280≥1.5、 OD260/230≥1.2、 QC/NC=0.5-2.0 |
| 基因組注釋 | 至少6個不同時期或不同部位的樣品，推薦kinnex Iso-seq 3M/GS 數(shù)據(jù)量 |
| Hi-C輔助組裝（二代平臺） | 新鮮組織進行甲醛交聯(lián)，1個Hi-C文庫至少需要新鮮血液約5 ml或組織1 g，推薦2-3 g組織量 |
注：若提供組織樣品，則植物樣本需為無菌黃化苗、組培樣品或嫩葉；動物樣本為肌肉、血液等脂肪含量較少的組織。盡量選擇同一個體取樣，以減少個體差異性對后續(xù)拼接的影響。如果動物樣本的性別決定模式是XY型，則盡量選擇雌性個體（XX型），如果是ZW型，則盡量選擇雄性個體（ZZ型）。
多組學(xué)技術(shù)助力油松基因組適應(yīng)繁殖機制和進化解析
The Chinese pine genome and methylome unveil key features of conifer evolution
期刊：Cell 合作方式：共同作者 影響因子：41.582 發(fā)表時間：2022.01 合作單位：北京林業(yè)大學(xué)研究 對象：35年生無性系優(yōu)良油松的新芽
油松，染色體水平基因組，甲基化
針葉樹在世界森林生態(tài)系統(tǒng)中占主導(dǎo)地位，是種植最廣泛的樹種之一。針葉樹基因組屬于大型基因組，存在高度重復(fù)序列（70%-80%），因此基因組組裝難度較高。
研究者利用三代測序、Hi-C輔助組裝等技術(shù)，組裝獲得了25.4 Gb染色體水平的油松基因組。通過使用來自760個生物樣本的大規(guī)模RNA-seq數(shù)據(jù)來輔助基因結(jié)構(gòu)注釋，揭示油松基因組擴展、生殖過程和適應(yīng)性進化的多重基因組特征和分子機制。
材料選擇：35年生無性系優(yōu)良油松的新芽
測序策略：
DNA：DNA小片段文庫，103X；三代基因組測序，103X；二代測序，Hi-C文庫
RNA：二代測序，構(gòu)建RNA文庫
油松基因組研究給針葉樹進化研究提供了新思路，為今后進一步開展針葉樹適應(yīng)與發(fā)育研究提供了數(shù)據(jù)參考。
研究者首先通過二代測序，對油松基因組大小進行評估，隨后利用三代測序數(shù)據(jù)進行自校正和組裝，成功構(gòu)建出24.4 Gb（96.1%，12條染色體）的油松高質(zhì)量的染色體水平基因組。
針葉樹中的基因通常多于二倍體被子植物，基因復(fù)制導(dǎo)致了許多基因家族的擴張。在基因復(fù)制的不同類別中，油松的旁系同源主要來源于分散重復(fù)（DSD），很少來自全基因組復(fù)制（WGD），油松發(fā)生近期全基因組復(fù)制事件概率較低。
圖1 油松高質(zhì)量基因組組裝
油松的基因組存在大量的長內(nèi)含子，總內(nèi)含子/外顯子長度與基因組的大小呈正相關(guān)，基因表達(dá)水平的差異與基因長度和內(nèi)含子數(shù)有關(guān)。長基因的RNA剪接和DNA甲基化檢測結(jié)果表明，幾乎所有CG和CHG位點都發(fā)生了甲基化，DNA甲基化可能參與了長內(nèi)含子的準(zhǔn)確識別。
圖2 油松基因組的基因空間結(jié)構(gòu)和復(fù)雜性展示
通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)了3,623個顯著擴張的家族基因，主要參與生物和非生物脅迫反應(yīng)。通過鑒定油松中的轉(zhuǎn)錄因子（TF）和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（TR）家族，發(fā)現(xiàn)對低溫高度敏感的AP2/ERF基因家族成員可能在油松的低溫適應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在候選基因編碼酶鑒定中，萜烯合成相關(guān)基因在不同年齡的油松中有明顯的表達(dá)模式，新形成的針葉可能是萜烯的主要合成部位。
圖3 油松中萜烯的合成途徑
被子植物中具有很多調(diào)節(jié)開花的關(guān)鍵基因，但油松中缺少很多同源基因。FT/TFL1-like基因是被子植物中調(diào)節(jié)開花的關(guān)鍵基因，但油松中僅有2個拷貝，但在其他針葉樹中一般有4-6個拷貝。研究者在擬南芥中做了轉(zhuǎn)基因驗證， 過表達(dá)了這兩個基因，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出明顯的晚開花表型。
通過對油松基因組中12個高表達(dá)的MADS-box基因的酵母雙雜交檢測，發(fā)現(xiàn)兩個AGL6-like基因（PtDAL1和PtDAL14）在油松中有不同的表達(dá)模式，其中PtDAL14在生殖器官中特異性表達(dá)，與其他MADS-box轉(zhuǎn)錄因子蛋白相互作用，表明AGL6-like基因可能作為MADS-box轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用的橋梁，從而形成互作網(wǎng)絡(luò)。最后研究者提出了一個控制油松雌雄球果發(fā)育的模型，為今后針葉樹生殖發(fā)育研究提供了一張藍(lán)圖。
圖4 油松中12個MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及蛋白互作模型
從染色體層面看，基因組甲基化水平與油松的TE覆蓋率顯著相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)攜帶TE的基因區(qū)域的平均甲基化水平遠(yuǎn)高于不攜帶TE的基因區(qū)域，但TSS和TES區(qū)域的平均甲基化水平始終較低。DNA甲基化對于TE基因組的擴張產(chǎn)生了影響，但未有證據(jù)表明，油松甲基化程度隨樹齡的增加而下降。LTR-RTs代表了大部分TEs，不平等重組（UR）是植物中一種重要的LTR-RT清除機制，針葉樹的UR率可能比被子植物小型基因組低得多，SGS3-RDR6-RdDM通路可能是針葉樹中主要的DNA甲基化途徑。
圖5 油松中DNA甲基化及轉(zhuǎn)座子擴張
研究者構(gòu)建了當(dāng)前大型基因組中連續(xù)性最好的高質(zhì)量染色體水平的油松基因組。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的不斷擴張和緩慢清除是導(dǎo)致針葉樹基因組巨大的重要原因，具有超長內(nèi)含子的大基因往往表達(dá)水平較高。與被子植物相比，油松具有獨特的生殖系統(tǒng)。油松基因組的構(gòu)建為其獨特適應(yīng)性和發(fā)育研究、生殖生物學(xué)研究及基因組輔助育種進化和基因組學(xué)研究提供了重要參考。
Niu S.H., Li J., Bo W.H., et al.The Chinese pine genome and methylome unveil key features of conifer evolution. Cell, 2022, 185(1):1-14.